化合物標的タンパク質解析

化合物標的タンパク質解析
Evaluation of target protein(s) for the test compounds

(担当:掛谷 秀昭)
(Member in charge: Hideaki Kakeya)

【概要】
Introduction

細胞表現型解析などにより強力な生物活性が見出された被検化合物の詳細な作用機序解析には、ケミカルバイオロジー的手法を活用して物理化学的に相互作用するタンパク質(標的タンパク質/結合タンパク質)を探索・同定する手段が有用である。 本支援では、被検化合物の標的タンパク質探索用分子プローブを設計・創製し、感受性細胞を用いて結合タンパク質の探索・同定を行う。本支援により、複数の結合タンパク質の検出が想定されるが、いずれも適宜、生化学的な検証が必要となる。その際、被検化合物の細胞株パネル解析、トランスクリプトーム解析、プロテオーム解析などの知見は、標的タンパク質を絞り込むうえでも有用な知見となりうる。

Chemical biology approach is powerful way for the mode of action analysis of the bioactive compounds found by cell morphology and phenotypic screening systems. Aim of this evaluation is to screen and identify binding protein(s) of the test compounds by using the molecular probes that are designed and synthesized based on their structure-activity relationship (SAR) study. Thereafter, further biochemical analysis is necessary for their confirmation. Cell line panel analysis, transcriptome analysis, and proteomic analysis of the test compounds are useful for determining the target protein(s).

【方法】*1
Method

被検化合物*2,3の構造活性相関研究の知見がある場合、結合タンパク質の探索・同定用分子プローブを合成するためにタグ(ビオチン基など)を含むリンカー挿入部位を検討・決定する*4。挿入部位決定後、結合タンパク質の探索・同定用分子プローブを合成する。続いて、被検化合物が感受性を示す細胞を用いたプルダウン実験により、結合タンパク質の探索・同定を行う(in vitro or in cells)。本方法により、複数の結合タンパク質候補が得られるが、いずれもその後の生化学的な検証が必要である。

*1被検化合物の標的タンパク質の探索・同定用プローブの設計・創製は、被検化合物の化学構造に大きく依存する。
*2被検化合物の量は10 mg以上が望ましい。
*3被検化合物の力価(IC50値等)は、1 μM以下が望ましい。
*4被検化合物内に適切な挿入部位がない場合、直接、光親和性官能基(アジド基、ジアジリン基等)を含むビーズを利用する場合がある。

The molecular probes for pull-down experiments are designed and synthesized based on structure-activity relationship (SAR) study.*1-4 The pull-down experiments are, then, performed by using the test compounds-sensitive cell lines, and the binding protein(s) are identified in vitro or in cells. Thereafter, further biochemical analysis is necessary for their confirmation.

*1Design and synthesis for the molecular probe depends on chemical structure of the test compounds.
*2Amount of the test compounds is preferred over 10 mg.
*3Titration (i.e. IC50 value) of the test compounds is preferred under 1 μM.
*4Beads with photoaffinity linker including azide and diazirine is useful for the molecular probes.

【評価】
Evaluation

結合タンパク質の探索・同定用分子プローブが優先的に結合するタンパク質を化合物結合タンパク質候補とする。

Proteins detected preferentially by the molecular probe are candidates as the binding proteins for the test compounds.

【支援条件】
Conditions

本支援項目は、共同研究ベースで実施させて頂きます。

We perform this support as collaboration study

【参考文献】
References

  1. Otsuki, S., Nishimura, S., Takabatake, H., Nakajima, K., Takasu, Y., Yagura, T., Sakai, Y., Hattori, A., Kakeya, H. Chemical tagging of a drug target using 5-sulfonyl tetrazole. Bioorg. Med. Chem. 23: 1608-1611 (2013). https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2013.01.092
  2. Moriyama, A., Katagiri, N., Nishimura, S., Takahashi, N., Kakeya, H. In vivo linking of membrane lipids and the anion transporter band 3 with thiourea-modified amphiphilic lipid probe. Sci. Rep. 5: 17427 (2015). https://doi.org/10.1038/srep17427
  3. Kakeya, H. Natural products-prompted chemical biology: Phenotypic screening and a new platform for target identification. Nat. Prod. Rep. 33: 648-654 (2016). https://doi.org/10.1039/c5np00120j
  4. Sakai, M., Takahashi, N., Ikeda, H., Furutani, Y., Higuchi, S., Suzuki, T., Dohmae, N., Kobayashi, S., Harada, H., Kojima, S., Matsuura, T., Hattori, A., Kakeya, H. Design, synthesis, and target identification of new hypoxia-induced factor 1 (HIF-1) inhibitors containing 1-alkyl-1H-pyrazole-3-carboxamide moiety. Bioorg. Med. Chem. 47: 116375 (2021). https://doi.org/10.1016/j.bmc.2021.116375
  5. Nagumo, Y., Kakeya, H., Shoji, M., Hayashi, Y., Dohmae, N., Osada, H. Epolactaene binds human Hsp60 Cys442 resulting in the inhibition of chaperone activity. Biochem. J. 387: 835-840 (2005). https://doi.org/10.1042%2FBJ20041355
  6. Kanoh, N. Honda, K., Simizu, S., Muroi, M., Osada, H. Photo-cross-linked small-molecule affinity matrix for facilitating forward and reverse chemical genetics. Angew. Chem. Int. Ed. 44: 3359-3362 (2005). https://doi.org/10.1002/anie.200462370
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