In vivoハイスループット解析/ゼブラフィッシュモデル

ゼブラフィッシュ胚の表現型による分子プロファイリング
Molecular profiling based on the zebrafish phenotype analysis

(担当:西谷 直之)
(Members in charge: Naoyuki Nishiya)

本支援では、脊椎動物モデル生物であるゼブラフィッシュの表現型を指標にし、発生シグナル経路の制御活性を評価する。また、他の細胞レベルの解析結果を個体レベルで再評価し、哺乳類モデル生物へつなぐ機能も果たす。

We evaluate regulatory activities of the developmental signaling pathways with phenotypic screenings in embryos of zebrafish, a vertebrate model organism. In addition, this system re-evaluates results of other in-cell evaluation systems in vivo, and functions as transition to the mammalian analyses.

(A)細胞運動阻害活性評価系
Wnt/β-catenin pathway inhibition assay

【概要】
Introduction

Wnt経路は、線虫、ショウジョウバエ、哺乳類に至るまで生物種を超えて保存されており、初期発生、器官形成、細胞増殖・分化・運動などを制御する。様々な悪性腫瘍や骨疾患などヒトの疾患への関与が知られ、医薬品の標的シグナルとしても注目されている。また、Wntは、再生医療の分野でも重要なツールとなっている。Wntシグナルには、Wnt/β-カテニン経路、Wnt/PCP経路、Wnt/Ca2+経路などが知られているが、本評価系では、最も知見の蓄積しているWnt/β-catenin経路の阻害活性を評価する。

The Wnt pathway is evolutionally conserved across metazoans from invertebrates, such as nematodes and insects, to mammals, and plays essential roles in embryogenesis, organogenesis, cell proliferation, differentiation, and motility. Moreover, The pathway is related to human diseases including malignant tumors and bone disorders, and has gathered attention as a therapeutic target. Wnt ligands have also been key reagents in regenerative medicine. While the Wnt pathway includes the Wnt/β-catenin, Wnt/PCP, and Wnt/Ca2+ pathways, this screening system evaluates the Wnt/β-catenin pathway, the most established pathway.

【方法】
Methods

ゼブラフィッシュ受精卵(6時間胚)をGSK3阻害剤(6-bromo-indirubin-3′-oxime、BIO)で処理することにより、β-cateninの蓄積が起こり、Wnt/β-catenin経路の異常活性化に起因する眼の形成不全を特徴とする形態異常が起こる。96ウェルプレートの1ウェルに受精卵を5個体ずつ入れ、受精後5.5時間に試験化合物を処理する。30分経過後、2 μM BIOを加え、受精後30時間まで飼育する。ゼブラフィッシュ胚の眼形成が回復するか評価する。

Treatment of zebrafish embryos at 6 hours-post-fertilization (hpf) by a GSK3 inhibitor (6-bromo-indirubin-3′-oxime、BIO) accumulates β-catenin, resulting in a characteristic “eyeless” phenotype led by aberrant activation of the Wnt/β-catenin pathway. Five fertilized eggs are placed in a well of a 96-well plate and treated with the test compounds at 5.5 hpf. After 30 minutes, 2 μM BIO are added and incubated until 30 hpf. Restoration of the eye development by the test compounds is evaluated.

【化合物の評価】
Evaluation of compounds

5個体中3個体以上の眼形成が回復した場合、陽性と判定する。初期スクリーニングとしては、化合物濃度200μMで処理する。判定不能レベルの毒性が生じた場合、LD50(50%致死濃度)の25~50%の濃度で再評価する。

When three out of five embryos restore the eye development, the test compound is judged positive. In an initial screening, the test compounds are subjected to the assay at 200 μM. If severe toxicity occurs, the compound will be re-evaluated at 25-50 % concentration of its 50% lethal dose (LD50).

(B)発生シグナル制御in vivo評価

【概要】
Introduction

Wnt経路に加え、TGF-β/BMP経路、ヘッジホッグ経路、FGF経路などの発生シグナル経路も抗悪性腫瘍薬をはじめとする医薬品の標的経路として脚光を浴びている。本評価系では、(A)Wnt/β-catenin経路阻害活性評価や他の細胞レベルの解析から発生シグナル制御活性が陽性と判定された化合物について、2次評価として形態形成異常について解析する。形態異常を示す化合物については、in situ ハイブリダイゼーションによって詳細解析する。

In addition to the Wnt pathway, developmental signaling pathways, such as TGF-β/BMP, hedgehog, and FGF pathways, has been highlighted as target pathways for pharmaceutical therapeutics including anticancer drugs. As a secondary evaluation, this evaluation system analyzes morphological abnormalities caused by compounds judged as positive for activities on developmental signaling pathways in other in-cell assays in addition to (A) Wnt/β-catenin pathway inhibition assay. Test compounds that cause morphological abnormalities are further analyzed by in situ hybridization.

【方法】
Methods

段階希釈した試験化合物(上限200μM)でゼブラフィッシュ受精卵(6時間胚)を処理し、受精後30時間まで飼育し、LD50を求める。形態形成への影響は、LD50の25~50%濃度で評価する。明確な表現型を示す試験化合物については、各種中胚葉マーカー遺伝子などをプローブに用いたin situハイブリダイゼーションを行う。

To estimate LD50, zebrafish embryos are treated with serial dilution of the test compounds at 6 hpf, and are incubated until 30 hpf. Effects on morphogenesis are analyzed at 25-50 % concentration of the LD50. For compounds that cause clear phenotypes, in situ hybridization is performed using probes for mesoderm marker genes.

【化合物の評価】
Evaluation of compounds

得られた表現型は実態顕微鏡下で観察し、画像と所見を報告する。

Obtained phenotypes are observed under a dissecting microscope, and are reported with images.

【参考文献】
References

  1. Nishiya N, Oku Y, Kumagai Y, Sato Y, Yamaguchi E, Sasaki A, Shoji M, Ohnishi Y, Okamoto H, Uehara Y.“A zebrafish chemical suppressor screening identifies small molecule inhibitors of the Wnt/β-catenin pathway.” Chem Biol. 21: 530-540 (2014). https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2014.02.015
  2. Yonezawa H, Ogawa M, Katayama S, Shimizu Y, Omori N, Oku Y, Sakyo T, Uehara Y, Nishiya N. “Clotrimazole inhibits the Wnt/β-catenin pathway by activating two eIF2α kinases: The heme-regulated translational inhibitor and the double-stranded RNA-induced protein kinase.” Biochem Biophys Res Commun. 506:183-188 (2018). https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2018.10.053
  3. Yonezawa H, Sugawara A, Sakyo T, Uehara Y, Kawano T, Nishiya N. “IMU1003, an atrarate derivative, inhibits Wnt/β-catenin signaling.” Biochem Biophys Res Commun. 532:440-445 (2020). https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2020.08.031
  4. Yonezawa H, Ikeda A, Takahashi R, Endo H, Sugawara Y, Goto M, Kanno M, Ogawa S, Nakamura K, Ujiie H, Iwatsuki M, Hirose T, Sunazuka T, Uehara Y, Nishiya N.” Ivermectin represses Wnt/β-catenin signaling by binding to TELO2, a regulator of phosphatidylinositol 3-kinase-related kinases.” iScience 25: 103912 (2022). https://doi.org/10.1016/j.isci.2022.103912
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